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创新结核诊断

结核:人类健康的严重威胁

结核是一种全球范围的主要传染病,尤其是在发展中国家和地区,结核病更是以高患病率、高耐药率和高死亡率而成为严重的公共健康威胁。中国是结核病高负担国家之一。中国政府高度重视结核病的防控工作,自2001年实施《全国结核病防治规划(2001~2010)》来,在各级政府和结核病防控及医疗工作者的大力努力下,我国结核病防控工作取得了重要成绩。要遏制结核病蔓延,早期的正确诊断是切断传播途径、及时进行规范化治疗是广大结核防治工作者的重要任务。

 

流行病学

根据世界卫生组织(WHO)2013年报告,中国2012年报告(新)发病人数约100万人,在22个结核高负担国家中列第二位。我国的结核患病率西部高于中部和东部,涂阳患病率中部高于西部和东部。

目前全球的疫情为:

-2012年全球新发结核病例为860万人,80%在22个“结核高负担国家”,其中东南亚占29%,非洲占27%,西太平洋占19%。印度和中国各占总数的26%和12%;

-在860万新病例中约110万人(13%)为HIV阳性,这些病例的75%在非洲;

-TB死亡约130万人,其中98万人为HIV阴性患者,32万人为HIV阳性患者;

-在过去10年中新发病例每年约下降约2%,而从1990年到2012年间TB死亡率下降了45%;11个高负担国家在控制新发病率、减少病人数、降低死亡率方面没有达到WHO目标;

-全球在TB-MDR诊断和治疗方面的进展缓慢。2012年约45万TB病人为MDR,因此死亡的为17万人,而2012年TB-MDR高负担国家中只有<25%的病人得到检测。

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实验室诊断

目前结核病辅助诊断主要有细菌学免疫学分子生物学三类。这三类技术各有优势和不足:细菌学直接识别或通过培养识别并鉴定TB,包括痰涂片镜检和分枝杆菌培养和分离鉴定。痰涂片简单方便,成本也较低,但是阳性检出率非常低,不是理想的筛查工具。培养被认为是“金标准”,但由于分枝杆菌生长特别缓慢,固体培养一般4-6周才能长出,而BD或生物梅里埃的快速液体培养也需要2周时间,因此它无法在门诊时就及时提供病人是否感染TB的关键信息;免疫学主要的优势是低成本和快速,操作简单方便,但它是检测血液中TB抗体为主的间接方法,其对TB的检测敏感度和特异性都有较大不足,因此WHO已经不推荐它作为活动性TB诊断方法;而分子学方法直接检测TB特有的核酸序列,在时间和灵敏度方面都具有优势,是目前TB体外诊断的发展趋势,不过其应用的瓶颈在于对检测环境设施的要求和对操作人员的专业和操作技能要求都比较高,试剂的高成本也是阻碍普及应用的一大障碍。

优思达创新TB分子检测

EasyNAT®简介
EasyNAT® 结核分枝杆菌恒核酸检测试剂盒(恒温扩增-试纸条法)(以下简称EasyNAT™ TB),将病原体DNA核酸恒温扩增技术和扩增产物核酸试纸条检测技术地融为一体。检测过程分样本处理及核酸提取、恒温扩增和快速检测三步。首先,使用目前实验室常用方法将痰标本制备并提取核酸,然后使用本试剂盒交叉引物恒温扩增技术(CPA)将提取的病原体核酸模板进行恒温扩增,接下来用一次性核酸扩 增物检测装置对DNA扩增物进行定性检测。扩增用简单恒温装置如金属浴即可完成。扩增和检测过程均在物理封闭条件下完成,能有效防止扩增物交叉污染。优思达的试剂玻璃化技术使产品可以常温运输。EasyNAT®检测灵敏度 为10个病原体,操作简便快速,,摆脱了分子学诊断对昂贵仪器和高要求实验室的依赖,是一种痰涂镜检的很好的补充检测以提高涂阴标本的检出率,尤其适用于基层医院结核分枝杆菌的快速筛查。该检出方法得到WHO新技术推荐

本试剂盒使用的二项核心技术 - CPA和一次性防交叉污染核酸试纸条检测装置 - 均为优思达公司原创,拥有自主知识产权。其中CPA技术是我国唯一自主创新的核酸扩增技术。

问题和回答

问: EasyNAT™试剂盒的性能如何?
答: 根据一项2008年3月至6月在上海市疾控中心进行的278例临床验证的结果显示,EasyNAT™与目前作为TB检测“金标准”的快速培养法有相似的灵敏度,比抗酸杆菌涂片具更 高的阳性检测率。
上述临床验证共收录180名来自上海市三家医院,根据临床症状和检查入选的结核疑似病人,以及98名非结核病人(包括肺癌、肺水肿和其它肺部疾病)的痰液。所有痰标本都痰涂片镜检,并做 L-J固体培养,BactT/Alert 3D快速培养和EasyNAT™试剂盒检测。在180例TB疑似病例中上述检测的阳性检出率分别为痰涂片镜检36.1% (65/180)、L-J固体培养38.9% (70/180)、BactT/Alert 3D快 速培养53.9% (97/180)和EasyNAT™试剂盒50.6 % (91/180)。
以BactT/Alert 3D快速培养作为对照,EasyNAT™的灵敏度为92.8%(90/97),特异性为98.8%(82/83);阳性预测值为0.989(90/91),阴性预测值为0.921(82/89)。

2012年3月-2012年10月,由中国防痨协会牵头在河北省正定县、山东省长清县、河南省新密市和北京市昌平区4个区县级结防机构进行了一个2,200例的大型临床研究,连续纳入初诊肺结核可疑症状者,每例患者留取3份痰标本。实验室工作人员按要求对收取到的痰标本进行涂片镜检、简单法固体培养和EasyNAT检测。国家级收集全部菌株完成16S-23S间隔区测序菌群鉴定。以固体培养为金标准,以病例为单位,评价EasyNAT检测对结核分枝杆菌的检出能力,包括灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。

结果显示,1)以固体培养试验及测序菌群鉴定结果为金标准,按照病例为单位,EasyNAT方法检测结核分枝杆菌的灵敏度为84.1%,特异度97.8%,阳性预测值83.4%,阴性预测值97.9%。在涂阴患者中,EasyNAT方法检测结核分枝杆菌的灵敏度为59.8%,特异度98.0%,阳性预测值59.1%,阴性预测值98.0%。现场实施期间,省级和国家级参比实验室定期对项目点进行督导。项目结束后对实验室操作人员进行EasyNATTM检测技术可接受度问卷调查;2)EasyNATTM检测从标本处理到获得检测结果仅需4个小时左右即可完成;培养试验从痰标本处理接种到结果报告所需时间平均52.5天;3)通过可接受度问卷调查,83%的工作人员认为EasyNAT检测易于接受。相比固体培养试验,所有人均认为EasyNAT检测对实验室人员的感染风险较小。该研究结果表明,在县(区)级结核病实验室使用EasyNAT检测方法与固体培养试验相比,EasyNAT能够明显缩短患者的诊断时间,具有较高的灵敏度和特异度,有助于早期、快速发现结核病患者,在我国结核病防治规划中具有推广应用的前景。

问: EasyNAT™试剂盒对结核诊断有什么帮助?

答: 超过90%的结核患者病人在出现结核症状时会到县级综合性医院、乡镇卫生院、私人诊所或其它医疗机构就诊。医生会根据临床症状、胸片及痰涂片镜检来发现疑似病例或临床诊断病例。其 中痰涂片镜检是主要的实验室筛查方法。但是检出率低是痰涂片镜检的一大缺陷,通常只有30%左右甚至更低,而分离培养需要6~8周的时间。此时,病人的漏检或等待培养结果能导致患者延误诊断和治 疗,增加传播的风险。EasyNAT™快速分子检查能提高痰涂片镜检阴性病例的检查率。根据上述临床验证结果,EasyNAT™在痰涂片阴性标本中的检测阳性率分别为24.3%,并在2小时内就可以 出结果,可防止交叉污染,为快速诊断提供了检测手段,有效解决了临床实际问题。

问: EasyNAT™适合哪些地方使用?
答: EasyNAT™适用于各级结核病防治所及肺科医院、胸科医院、传染病院等临床医院,尤其是基层县市级医院和结核病防治所。由于基层医疗机构在实验室设备和人员方面的资源和投入 有限,而EasyNAT™不需昂贵的仪器和专门的分子实验室,简便快速,所以能让先进的分子检测技术服务范围更广的普通民众。

问: 那么EasyNAT™检测的基本条件和注意事项有哪些?
答: 在痰标本提取核酸过程中可能需要4000转/分的离心机。CPA恒温扩增需要使用能保证63℃左右的任何简单的恒温装置,如水浴或金属浴。其它就是一些常用的实验室耗材。在操作时务必严 格按照产品说明书进行。一些大意造成的误操作会造成检测失败,如,将完成扩增的PCR管要按图示管尖朝外放置而不能倒置等。总的来说,EasyNAT™试剂盒使用简便,一般的实验室工作人员都能 很快学习掌握。

问:EasyNAT™检测成本如何?
答: 首先EasyNAT™检测不需要昂贵的PCR仪和专门的分子实验室,减少了大笔固定资产投入,而试剂的成本和普通PCR试剂相仿。将来随着普及应用成本还会进一步降低。

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