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SNP检测

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)的筛选及其检测已随着人类基因组测序工作的完成而引起广泛的关注。目前SNPs检测的方法大多以PCR技术为基础,与荧光、质谱法、基因芯片或直接测序等方法结合,并已进入SNPs检测的高通量时代。但这些方法大多操作复杂、价格昂贵、检测时间长,而且需要大型的仪器设备,因此并不适合于大多数临床医院。优思达公司结合PCR技术和核酸试纸条快速检测技术,发明了一种操作简单、成本低的SNPs检测方法,利用带标记的引物进行等位基因特异性扩增(Allele Specific Polymerase Chain Reaction,AS-PCR),然后用一次性核酸扩增物检测装置进行SNPs检测。此方法已申报了中国专利和国际专利,其反应原理和步骤如图6:


图6  PCR & AS-PCR核酸试纸条法检测SNPs原理示意图

在PCR & AS-PCR核酸试纸条法检测SNPs中主要包括用于扩增的特异性PCR扩增引物,一条5’末端带生物素标记的等位基因特异性引物,一条3’末端带FITC标记的特异性探针。其过程主要包括以下几个步骤:
   先对包含SNP位点的靶模板通过PCR进行扩增,以便靶序列的富集;进行PCR扩增的引物并不带任何的标记;
    利用AS-PCR根据SNP的碱基类型进行特异性扩增。在适当的Tm情况下,只有当5’末端标记生物素的等位基因特异性引物与扩增产物上要检测的SNP位点片段完全互补时,该引物才能在DNA聚合酶的作用下进行延伸,并与反应液中3’末端标记FITC的探针进行结合,形成同时标记生物素和FITC标记的杂交产物。
检测时,杂交产物将先后与标记亲和素的颗粒和检测线上的抗-FITC结合,并形成肉眼可见的有色线条,此为阳性;若加入等位基因特异性引物末端不能与模板完全匹配,那么就无法形成同时标记生物素和FITC 的杂交产物,也就不能再检测线上形成肉眼可见的有色线条,则为阴性。

    技术特点:
   便捷、快速:一次PCR反应.所有引物和探针已预先配制在反应液中,用户只需加入模板。靶序列扩增和特异性SNP扩增由一个PCR程序控制,一气呵成;从扩增到检测结果,不超过2个小时;
   无扩增物交叉污染:PCR反应完成后,不需打开反应管盖,直接放入检测装置,在封闭的条件下检测,从而防止了扩增产物泄露,防止了因交叉污染造成的假阳性;
   低成本:用户不需昂贵的荧光定量PCR仪,只需一台普通PCR仪即可。
 

    SNPs检测应用:
   与SNPs直接相关的人类遗传性疾病的分子诊断
   人群中可以确定人类健康遗传基础的SNPs的筛查与分型
   人体药物反应差异性检测与筛查应用于搭配诊断(Companion Diagnostics)
   人群中某种疾病易感基因的筛查
   病原体已知耐药基因的检测
   器官移植中供体和受体间的配对选择
   法医研究中罪犯身份的鉴别及亲子鉴定
   病原体的基因分型,如HBV基因分型
   病原体的耐药检测,如TB耐药,HBV耐药