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交叉引物恒温扩增技术

核酸扩增是核酸分子诊断的关键技术。根据核酸扩增反应中温度变化要求,可以将核酸扩增技术分为两大类:一类是PCR核酸扩增技术,另一类是核酸恒温扩增技术。

PCR技术是指通过控制温度的变化来实现DNA扩增的三个步骤:模板变性(如95℃)-引物杂交(如58℃)-DNA合成(如72℃)。这种温度变化的循环重复(如重复35次)过程通常由精密而复杂的仪器(PCR仪)来控制。核酸恒温扩增技术(Nucleic Acid Isothermal Amplification,NAIA)则是扩增反应的全过程均在同一温度下进行,不须象PCR反应那样需要经历几十个温度变化的循环过程。这一特点使得它们对扩增所需仪器的要求大大简化,反应时间大大缩短,因而具有巨大的应用价值,成为分子诊断行业发展中的热点。

目前的NAIA技术主要有滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification,RCA)、转录酶扩增技术 (Transcription Mediated Amplification,TMA)、依赖核酸序列扩增技术 (Nucleic Acid Sequence Based Amplification,NASBA)、链置换扩增技术(strand displacement amplification,SDA)、环介导的等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)、解链酶扩增技术(Helicase Dependent Amplification,HDA)。上述各种核酸扩增技术均由国外公司所拥有。

交叉引物扩增技术(Crossing Priming Amplification,CPA)是完全由优思达公司独立研发成功的一种新的核酸恒温扩增技术,也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术。CPA与优思达公司其他技术相结合(如快速核酸提取技术、核酸试纸条检测技术等),形成一个完整的现场快速分子检测平台,可以开发出众多恒温扩增检测试剂盒,广泛应用于分子诊断、防疫检疫、生物医学研究、个体化治疗等领域。该技术已申请中国和美国发明专利,在美国《Molecular Diagnostics》等杂志发表论文二篇,并通过了比尔•盖茨基金会资助申请。

CPA扩增体系中除包含具有链置换功能的Bst DNA聚合酶外,还主要包括扩增引物和两条交叉引物。这些寡聚核苷酸链能依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性,使DNA的循环扩增能不断的实现。CPA扩增主要包含以下几个步骤:
    交叉正向引物CPF中的PFs与模板DNA中PFa互补,启动DNA合成,使得PRa被引入到所扩增的产物中;
    外围引物DP1s与PFa前端DP1a序列互补,通过链置换型DNA聚合酶向前延伸,一边置换CPF合成的能与CPR和DP2a结合的单链产物(结构3),一边与模板DNA形成双链产物(结构2);
    在结构3中,DP2a通过链置换型DNA聚合酶向前延伸,置换出由CPR所延伸的单链产物(结构5),同时合成与步骤2中由CPF延伸所产生单链DNA形成双链产物(结构4),而结构5相对起始的DNA模板,多了PRs和PFs两个片段序列;
    单链结构5中的3’端的PFa和PRs可分别与CPF中的PFs和CPR中的PRa互补结合, 可在链置换型DNA聚合酶的作用下延伸和置换出相应的单链产物。延伸产物相对结构5来说又增加了一个PFs区域(结构8);
    因此,扩增引物CPF和CPR的不断杂交和延伸,不仅使得结构5的长度不断的加长,从而引入更多CPF和CPR 3’端互补区域,同时也置换出了各种可与CPF和CPR 3’端互补的单链产物;
    通过CPF和CPR的不断杂交延伸和DNA聚合酶的链置换作用,使得DNA拷贝数不断的增加,从而达到基因扩增的效果。

使用本装置提取临床生物样品的核酸成本低廉,只需几分钟,可以应用于现场检测或实验资源较少的基层医院和经济不发达地区;同时也可以满足大医院特定情况下的需求,如急诊或床边的核酸快速诊断。该技术已申请发明专利,并取得盖茨基金会研发资助。

CPA基本原理如下:

图2 CPA扩增的反应原理图

与目前广泛使用的荧光PCR技术相比较,CPA技术有以下几个优点:
    反应速度快:反应时间约1小时,使试剂盒可用于检验检疫、突发性传染病的检测与监控现场检测或医院的床边诊断(Point-of-Testing, POCT);
    检测成本低:目前荧光光定量PCR仪价格昂贵,无法在很多中小医院普及。CPA扩增只需要离心机和一台简单的恒温装置,如普通的水浴锅、金属浴,即可进行扩增。
    操作简单:对操作人员的技能要求不高,绝大多数人通过简单培训或自学都可掌握,为核酸检测试剂的广泛应用创造了条件。